Ниже представлен точный протокол и настройки параметров для экстракции вирусной РНК на основе магнитных частиц в 96-луночном формате. Рабочий процесс включает добавление 50 мкл образца к 101 мкл смеси для лизиса/связывания и 20 мкл смеси магнитных частиц, за которыми следует серия контролируемых этапов встряхивания, магнитной сепарации и промывки — все они настроены на определенные скорости и время — перед фазой элюции объемом 30 мкл, в результате которой получается очищенная вирусная РНК, готовая к qRT-PCR.
Ключевой вывод: Надежное выделение РНК зависит не только от соотношения реагентов, но и от дисциплинированного обращения с планшетом (снимать с магнита для перемешивания, оставлять на магните для аспирации), запрограммированных скоростей пипетирования, которые защищают осадок частиц, и интенсивного 2-минутного этапа сушки на шейкере, который устраняет остатки этанола. Указанные ниже точные параметры превращают этот общий протокол в воспроизводимый рабочий процесс с высоким выходом.
Точный пятифазный протокол для экстракции вирусной РНК в 96-луночном формате
Все этапы, включающие добавление реагентов или встряхивание, выполняются при снятом с магнитного штатива планшете; вся аспирация супернатанта выполняется при надежно закрепленном на магните планшете для фиксации осадка частиц.
1. Лизис образца и связывание с частицами – инактивация вируса
Начинайте работу в боксе биологической безопасности 2-го класса до момента добавления лизирующего буфера.
- Добавьте 50 мкл образца в каждую лунку.
- Добавьте 101 мкл смеси для лизиса/связывания — это инактивирует вирусные патогены, делая последующие этапы безопасными для работы на открытом столе в соответствии с практикой BSL-2.
- Добавьте 20 мкл смеси магнитных частиц/связывания (предварительно тщательно перемешайте суспензию частиц на вортексе).
- Поместите планшет на шейкер и перемешивайте в течение 4 минут на умеренной скорости (положение регулятора 5).
2. Магнитная сепарация и первая промывка
- Перенесите планшет на магнитный штатив и подождите 2 минуты, пока частицы соберутся в осадок.
- Используя программируемый многоканальный дозатор, установленный на низкую скорость аспирации, осторожно удалите супернатант, пока планшет остается на магните.
- Снимите планшет с магнита, добавьте 100 мкл смеси промывочного раствора I и встряхивайте в течение 1 минуты при положении регулятора 5.5.
- Верните планшет на магнит, выдержите 1 минуту для осаждения и удалите супернатант медленной аспирацией.
3. Два этапа промывки на основе этанола (промывочный раствор II)
Выполните следующий цикл дважды:
- Сняв планшет с магнита, внесите 100 мкл смеси промывочного раствора II (используйте среднюю скорость дозирования для ресуспендирования частиц).
- Встряхивайте в течение 30 секунд при положении регулятора 5.5.
- Поместите планшет на магнит, выдержите 30 секунд для осаждения и медленно аспирируйте супернатант, пока планшет остается на магните.
4. Сушка частиц – устранение ингибиторов RT-PCR
После удаления супернатанта последней промывки необходимо испарить остатки этанола.
- Оставьте планшет на шейкере (без магнита) и встряхивайте интенсивно без жидкости в течение 2 минут при положении регулятора 9.
- Этот этап критически важен: остатки этанола будут ингибировать последующие ферменты обратной транскрипции и qPCR.
5. Элюция и финальный сбор
- Снимите планшет с шейкера, добавьте 30 мкл элюирующего раствора комнатной температуры.
- Встряхивайте в течение 4 минут на высокой скорости (положение регулятора 9) для полного ресуспендирования частиц. Если образуются комки, аккуратно перемешайте жидкость вверх-вниз с помощью ручного дозатора.
- Поместите планшет на магнитный штатив на 2 минуты, чтобы осадить частицы.
- Перенесите прозрачный супернатант (содержащий очищенную вирусную РНК) в планшет для хранения или qRT-PCR, используя низкую скорость аспирации, чтобы не потревожить осадок.
Скрытые факторы успеха: техника и правила обращения
Значения объемов и времени в протоколе — это лишь часть дела. Следующие операционные правила отличают надежный диагностический анализ от нестабильного.
Манипуляции с магнитным штативом – правило «Вкл/Выкл»
Держите планшет на магните во время каждого этапа аспирации или удаления супернатанта. Это предотвращает потерю частиц. И наоборот, всегда снимайте планшет с магнита перед внесением лизирующего буфера, промывочных растворов или элюирующего буфера — частицы должны быть полностью диспергированы для эффективной промывки и элюции.
Программируемые скорости пипетирования – защита осадка частиц
Запрограммируйте свой электронный многоканальный дозатор на низкую скорость для аспирации и среднюю скорость для дозирования.
Ручным многоканальным дозаторам часто не хватает контролируемого, равномерного усилия, необходимого для стабильного ресуспендирования частиц или аспирации супернатанта без захвата частиц. Если вы вынуждены использовать ручные дозаторы, придерживайтесь медленного, устойчивого ритма и никогда не касайтесь наконечниками осадка.
Ресуспендирование и сушка – решающие моменты
Перед первым использованием встряхивайте суспензию магнитных частиц на вортексе не менее 2 минут для обеспечения однородности. Во время элюции следите за образованием комков частиц; аккуратное ручное пипетирование может помочь спасти плохо ресуспендированный осадок.
После финальной промывки 2-минутное встряхивание для сушки при положении 9 точно балансирует удаление этанола и жизнеспособность частиц — пропустите его, и вы рискуете получить ингибирование qPCR; пересушите — и можете потерять эффективность элюции.
Понимание компромиссов и распространенных ошибок
Даже хорошо параметризованный протокол имеет нюансы, которыми необходимо управлять.
Остатки этанола против пересушивания
2-минутное встряхивание для сушки тщательно откалибровано. Сокращение времени оставляет остатки этанола, которые будут ингибировать ферменты обратной транскриптазы и полимеразы. Увеличение времени более чем на 2 минуты может привести к высыханию поверхности частиц, вызывая падение выхода РНК. Придерживайтесь 2-минутного окна.
Скорость встряхивания и риск перекрестного загрязнения
Положение регулятора 9 во время сушки и элюции создает интенсивное движение. В 96-луночном формате это может привести к образованию аэрозолей или разбрызгиванию капель, если планшет не герметичен. Используйте клейкую пленку или надежный коврик для планшета, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение лунок, особенно в условиях диагностики.
Потеря частиц при аспирации
Слишком быстрая аспирация, пока планшет находится на магните, является наиболее частой причиной потери частиц. Низкая скорость аспирации обязательна. Предпочтительны планшеты с U-образным дном, так как они концентрируют осадок в плотной точке, что облегчает обнаружение того, затягиваются ли частицы в наконечник.
Правильный выбор для вашего рабочего процесса
Адаптируйте протокол к вашей основной цели, используя эти рекомендации:
- Если ваша основная цель — максимизация выхода РНК: Убедитесь, что этапы встряхивания при лизисе и элюции (4 мин на положении 5 и 4 мин на положении 9) всегда выполняются полностью. Будьте готовы аккуратно перемешать частицы в элюирующем буфере, если остались комки, и никогда не сокращайте этап встряхивания частиц на вортексе перед использованием.
- Если ваша основная цель — высокая производительность и автоматизация: Используйте программируемый электронный дозатор с точно рекомендованными скоростями аспирации/дозирования. Запрограммируйте манипулятор планшетов так, чтобы он перемещал планшет на магнитный штатив и обратно точно в определенные моменты — автоматизация, нарушающая правило «Вкл/Выкл», разрушит воспроизводимость.
- Если ваша основная цель — биобезопасность и соответствие клиническим требованиям: Выполняйте все этапы до добавления лизирующего/связывающего буфера в боксе биологической безопасности II класса. После 4-минутного встряхивания для лизиса вирус инактивируется; последующие этапы промывки и элюции можно проводить на открытом столе с соблюдением практик BSL-2 (СИЗ, дезинфекция поверхностей, автоклавирование отходов).
Соединив точные соотношения реагентов и время с этими усовершенствованными методами работы, вы сможете превратить хороший протокол экстракции в надежно отличный — партия за партией.
Сводная таблица:
| Фаза протокола | Основные реагенты и объемы | Параметры встряхивания / обращения | Положение магнита |
|---|---|---|---|
| 1. Лизис и связывание | 50 мкл образца + 101 мкл лизис/связывание + 20 мкл частиц | Встряхивание 4 мин @ Положение 5 | Без магнита |
| 2. Промывка I | 100 мкл промывочного раствора I | Встряхивание 1 мин @ Положение 5.5; Осаждение 1 мин | Без магнита (Аспирация на магните) |
| 3. Промывка II (2x) | 100 мкл промывочного раствора II | Встряхивание 30 сек @ Положение 5.5; Осаждение 30 сек | Без магнита (Аспирация на магните) |
| 4. Сушка частиц | Нет | Сушка встряхиванием 2 мин @ Положение 9 (Интенсивно) | Без магнита (на шейкере) |
| 5. Элюция РНК | 30 мкл элюирующего раствора | Встряхивание 4 мин @ Положение 9; Осаждение 2 мин | Без магнита (Сбор на магните) |
Масштабируете свои диагностические анализы или оптимизируете рабочие процессы экстракции вирусной РНК? CamelBio предоставляет производителям средств диагностики, клиническим лабораториям и исследовательским институтам доступ к премиальному сырью для IVD, техническим услугам и экспертным консультациям — на каждом этапе от концепции до клиники. Свяжитесь с CamelBio сегодня, чтобы усовершенствовать свои рабочие процессы и достичь максимальной точности диагностики!